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Mar 27, 2023

blaCTXを保有するプラスミドの特性評価

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8595 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

CTX-M は blaCTX-M 遺伝子によってコードされており、広く分布している拡張スペクトルβ-ラクタマーゼ (ESBL) です。 これらは、腸内細菌科におけるβ-ラクタム系抗生物質に対する最も重要な抗菌薬耐性 (AMR) メカニズムです。 しかし、blaCTX-M 遺伝子の伝播における伝播性 AMR プラスミドの役割は、AMR の負担が大きく急速に広がっているアフリカではほとんど研究されていません。 この研究では、このような高い有病率と急速な蔓延の根底にあるメカニズムについて分子的な洞察を提供することを目的として、エチオピアのCTX-M産生大腸菌臨床分離株においてAMRプラスミドの伝播性、レプリコンの種類、中毒システムが分析されました。 地理的に異なる 4 つの医療現場からの尿 (84 件)、膿 (10 件)、および血液 (6 件) から得られた 100 件の CTX-M 産生分離株のうち、75% が CTX-M をコードする伝達性プラスミドを保有しており、CTX-M-15 が優勢でした。 (n = 51)。 F-FIA-FIB の組み合わせを含む単一の IncF プラスミド (n = 17) は、大量の blaCTX-M-15 遺伝子を保持していました。 さらに、IncF プラスミドは、複数の中毒システム、ISEcp1、および非セファロスポリン系抗生物質に対するさまざまな耐性表現型と関連していました。 さらに、IncF プラスミドの保有は、国際的なパンデミックである大腸菌 ST131 系統と関連しています。 さらに、いくつかの CTX-M コード化プラスミドは菌株の血清生存と関連していましたが、バイオフィルム形成とはそれほど関連していませんでした。 したがって、水平遺伝子伝達とクローン増殖の両方が、エチオピアの臨床現場における大腸菌集団間での blaCTX-M 遺伝子の迅速かつ広範な分布に寄与している可能性があります。 この情報は、地域の疫学と監視に関連するだけでなく、AMR 遺伝子を保有するプラスミドの普及の成功についての世界的な理解にも関連します。

抗菌薬耐性（AMR）は、世界的な医療システムの深刻な問題です1。 この問題は通常、広範な腸内細菌科に関連しています2。 この細菌科では、拡張スペクトルβ-ラクタマーゼ (ESBL) が、β-ラクタム型抗生物質を無効にする主要な AMR メカニズムです。 blaCTX-M 遺伝子によってコードされる CTX-M は、最も優勢で広く普及している ESBL 酵素タイプであり、大腸菌がその主要な生産源となっています 3,4。 CTX-Ms を産生する大腸菌の追跡は困難であり、根底にある伝播メカニズム、臨床的意義、および blaCTX-M 遺伝子の全体的な疫学についての詳細な調査が必要です。

細菌プラスミドは、AMR 遺伝子を含む外来遺伝子の異なる細菌種間の水平移動に不可欠な可動要素です。 これは高所得国で広範に調査されています5,6。 狭い宿主範囲のプラスミドに属する不和合性 (Inc) グループ F (IncF) は、AMR 遺伝子伝達に最も関連しています 7。 AMR プラスミドの水平拡散も、病原性をコードする遺伝子の獲得において重要な役割を果たします 8。 例えば、ESBL をコードするプラスミドは、パンデミック大腸菌配列型 (ST) 131 株やその他の病原性大腸菌 9 における毒性の潜在力の増強と関連しています。

アフリカでは、ESBL 産生大腸菌 10 の負荷が高いにもかかわらず、根底にある分子機構、病原性関連因子、および全体的なプラスミド媒介性 AMR 疫学についての知識はほとんどありません。 これに関する明確で最新のデータがなければ、毒性大腸菌の効果的な追跡と管理は実現できません。 我々は最近、エチオピアの 4 つの地理的に異なる医療施設から採取された CTX-M 陽性大腸菌臨床分離株の表現型の特徴付けを発表しました11。 この研究では、国際的な高リスク ST131 クローンに属するいくつかの分離株を含むさまざまな大腸菌系統群について報告しました11。 また、特定の分離株では代替β-ラクタマーゼ遺伝子保有が存在し、それらの分離株では明らかな多剤耐性（MDR）が存在することも明らかになりました11。 これらの特徴が伝播性 AMR プラスミドを介してレシピエント大腸菌株に伝達可能かどうかを知ることは興味深いことです。

プラスミド伝達性の有効性、ひいては MDR の蔓延を制限するには、まず既存の AMR プラスミドの生物学を理解する必要があります。 私たちの知る限り、これはエチオピアの臨床大腸菌分離株で同定されたプラスミドに対しては行われていません。 したがって、この研究では、まず AMR プラスミドの伝達性に焦点を当て、以前の研究で使用した臨床分離株の中からプラスミド レプリコンの種類を同定することから、この重要な研究を開始しました。 この研究では、ISEcp1 エレメントと blaCTX-M 遺伝子との関連性も調査しました。この挿入システムエレメントは、伝達可能なプラスミド上の CTX-M コード遺伝子に隣接して一般的に見出され、染色体捕捉、動員、および blaCTX-M 遺伝子の発現に重要な役割を果たしているからです。伝達可能なプラスミドからの AMR 遺伝子 6、7、12。 また、宿主複製中のプラスミドの維持は伝染性の重要な側面であるため、8 つのプラスミドにコードされた中毒システムの存在も評価しました 13,14。 最後に、プラスミドの複製、維持、伝達はバイオフィルムコミュニティに生息する細菌の影響を受けており 15、AMR プラスミドの保持は病原性大腸菌株の重要な毒性特性である血清耐性 16 に影響を与えている 17 ため、今回の研究ではこれらの関連性も調査されました。 そうすることで、この研究はエチオピアの臨床大腸菌分離株の中の既存の AMR プラスミドの生物学を初めて説明したものであり、したがって、MDR の急速な蔓延につながるプロセスに関する重要な知識に貢献することができ、その後標的として特定することができます。抑制のために。

CTX-M 遺伝子の拡散の分子基盤を決定するために、元の研究から 100 個の CTX-M 産生分離株を半ランダムに選択しました 11 (補足表 S1)。 研究の対象となる根拠は、(1) すべての分離株が CTX-M を産生すること、(2) すべての地理的研究施設が代表されること、という基準であった [NRL (National Reference Laboratory)-36; TASH（ティクル・アンベッサ専門病院）—31; ARH (エイダー紹介病院) 19; JUH (Jimma University Hospital)—14]、および (3) すべての系統グループを表す必要があります [系統グループ A (19); B1(4); B2(52); Ｃ（１６）； D (5)、および F (4)] (表 1)。 我々は、これらの臨床分離株の 75% (n = 75) が、CTX-M 決定基をコードする遺伝子を結合によって大腸菌 J53 AziR に、または化学的形質転換によって大腸菌 HB101 に導入する能力を持っていることを実証することができました (表 1)。 伝播性が証明された75株のうち、CTX-M-15をコードする遺伝子は51株（68.0％）で発現し、他のグループ1 CTX-M遺伝子は17株（22.7％）で発現し、グループ9 CTX-Mは7 つの分離株の遺伝子 (9.3%) (表 1)。 伝播性が証明できなかった臨床分離株の 25% (n = 25) のうち、5 つの系統群間で CTX-M をコードする遺伝子を同定しました。B2-ST131 分離株では blaCTX-M-15 遺伝子が優勢でした (表 1) ）。 増幅された DNA 断片の配列決定により、ISEcp1 遺伝子と blaCTX-M 遺伝子間の関連が確認されました。 驚くべきことに、親分離株 75 株のうち 73 株 (97.3%) とレシピエント株の 71 株 (94.7%) が ISEcp1 エレメント陽性でした。

別のβ-ラクタマーゼをコードする遺伝子（非ESBLs遺伝子）が、AMR遺伝子をレシピエント細菌に伝達する可能性のある75株のうち72株で検出された。 具体的には、blaTEM-1、blaOXA-1、および blaTEM-OXA 遺伝子が、元の親分離株 75 株のうち、それぞれ 13 株（17.3%）、16 株（21.3%）、および 39 株（52%）で検出されました（表 2）。 ESBL blaSHV 遺伝子は 4 株 (5.3%) の分離株で検出されました。 3 つの分離株 (4%) には、これらの 4 つの代替 β-ラクタマーゼ コード遺伝子がすべて欠如していました。 これらの同じ遺伝子型は、プラスミド受容株において特徴付けられました。 blaTEM-1、blaOXA-1、および blaTEM-OXA 遺伝子は、動員された AMR プラスミドを投与されたレシピエント株のそれぞれ 23 (30.7%)、13 (17.3%)、および 26 (34.7%) で検出されました (表 2)。 。 残りの 13 株 (17.3%) のレシピエント株は、これらの遺伝子をまったく獲得していませんでした。 さらに、ESBL blaSHV 遺伝子を獲得したレシピエント株は 1 つもありませんでした (表 2)。

我々は以前に、この研究で使用した親の臨床分離株間の複数の薬剤耐性プロファイルを評価しました11（補足表S1）。 この特性が AMR プラスミドの伝播性を通じてレシピエント細菌に与えられるかどうかを検討するために、我々は、75 の親臨床分離株すべてと、それに対応する AMR プラスミドのレシピエントに対して、ディスク拡散法を用いた抗菌薬感受性試験を実施しました。 75 の分離株はセフォタキシム、セフタジジム、セフェピムに対して 100% 耐性であり、我々の以前の発見が裏付けられました 11。 第 2 世代のプラスミド受容株では、この耐性率はセフォタキシムでは 100% を維持しましたが、セフタジジムとセフェピムではそれぞれ 90.7% と 88.0% にわずかに低下しました (図 1)。 シプロフロキサシン、スルファメトキサゾール/トリメトプリム・アモキシシリンクラブラン酸、ゲンタマイシン、セフォキシチン、アミカシン、メロペネムに対する耐性率は、それぞれ92.0%、88.0%、72.0%、50.7%、17.3%、1.3%、1.3%でした（図1）。 AMR プラスミド受容株の中で、これらの非 β-ラクタム系抗生物質に対する耐性率は、シプロフロキサシン、スルファメトキサゾール/トリメトプリム、ゲンタマイシン、アミカシンに対してそれぞれ 48%、65.3%、41.3%、1.3% でした (図 1)。 さらに、第 2 世代株の 56% は β-ラクタマーゼ阻害剤であるアモキシシリン クラブラン酸に対して耐性を示し、9.3% はセフォキシチンに対して耐性を示しましたが、メロペネムに対して耐性を獲得した株はありませんでした (図 1)。

75 の元の分離株と対応するプラスミド受容株によって示された抗生物質耐性パーセントの比較。 レシピエント株は、接合交配を介して達成される大腸菌 J53 AziR バックグラウンド (トランスコンジュゲート)、または化学的形質転換を介して達成される大腸菌 HB101 バックグラウンド (形質転換体) のいずれかに基づいています。 異なる親分離株（濃い灰色のバー）およびレシピエント分離株（明るい灰色のバー）の耐性パーセントは、CLSI ディスク拡散ブレークポイントに従っていました。 耐性は、参照株であるESBL陰性大腸菌ATCC 25,922およびESBL陽性肺炎桿菌亜種と比較した阻害ゾーンのサイズに基づいて、中間耐性および完全耐性を有する分離株として定義された。 肺炎ATCC 700,603。 試験された抗生物質は、アモキシシリン クラブラン酸塩 (AMC)、セフォタキシム (CTX)、セフタジジム (CAZ)、セフェピム (CEF)、セフォキシチン (FOX)、シプロフロキサシン (CIP)、アミカシン (AMK)、ゲンタマイシン (GEN)、メロペネム (MEM) でした。 ）、スルファメトキサゾールトリメトプリム（SXT）。

私たちの知る限り、エチオピアの臨床分離細菌が保有する AMR プラスミドの生物学は研究されていません。 我々は、確立されたPCRベースのレプリコンタイピング（PBRT）プロトコルを採用することにより、研究で使用した分離株の中からプラスミドレプリコンの種類を特定することにまず焦点を当てることから、この重要な研究を開始しました18。 移入された75個のCTX-M ESBLをコードするプラスミドのうち、64個（85.3％）のレプリコンが型分けされ、13の異なる組み合わせに分類される4つのIncグループが明らかになりました（図2）。 さまざまなレプリコン タイプを持つ IncF プラスミドは、すべてのプラスミドの中で最も多くの組み合わせでした。 プラスミド F-FIA-FIB レプリコン グループが 64 個中 27 個で最も頻繁に同定され (42.2%)、続いて FIA-FIB の組み合わせ (9.4%) でした (図 2)。 レプリコン タイプ F-FIB-I1-Iγ、F-FIB、および IncF レプリコン タイプはすべて 7.8% の頻度で検出され、I1-Iγ レプリコン タイプは 6.3% で検出されました (図 2)。 同定された他のタイプは、プラスミド受容株において 5% 未満の頻度で検出されました (図 2)。

エチオピアの医療センターから収集された臨床サンプルから得られた大腸菌分離株に由来するプラスミド レプリコン タイプの頻度。 結合または形質転換によって 1 つ以上のプラスミドを受け取った 75 のレシピエント株のうち、64 株には、選択した PCR ベースの方法で型を特定できるプラスミドが含まれていました。 IncF ベースのレプリコン タイプが最も多く同定されました。

また、レプリコンの種類と抗生物質耐性遺伝子との関連性も明らかにしました。 blaCTX-M-15を有する51個の伝達性プラスミド(表1を参照)のうち、45個(88.2%)がPBRTを使用して型分けされた。 これら 45 個の PBRT 型伝達性プラスミドのうち、35 個 (77.8%) は Inc レプリコン タイプの組み合わせを保持していましたが、残りの 10 個 (22.2%) は単一のレプリコン タイプのみを保持していました (表 3)。 F-FIA-FIB プラスミド レプリコンの組み合わせは、blaCTX-M-101、blaCTX-M-103、blaCTX-M-142、blaCTX-M-180、blaCTX-によってコードされる他のグループ 1 CTX-M タイプと頻繁に関連していました。 M-182 および blaCTX-M-225 (表 3)。 さらに、グループ 9 blaCTX-M-27 を保有する 6 つのプラスミドは、単一の IncF (n = 1) および F-FIA-FIB (n = 4) との明らかな組み合わせからなる 3 つの異なるレプリコン タイプに属していました。 F-FIA-FIB、I1-Iγ (n = 1) (表 3)。

対照的に、PBRTプロトコルでは、blaCTX-M遺伝子を保有する伝達性プラスミドを含む75分離株のうち残りの11株（14.7％）を18不和合性グループのいずれにも分類できなかった。 これらの分類されていない 11 株のうち、6 株 (54.5%) は blaCTX-M-15 を運ぶプラスミドを含み、4 株 (36.4%) は他のグループ 1 CTX-M をコードする遺伝子を持つプラスミドを持っていました (1 株は blaCTX-M-55、2 株は blaCTX) -M-180、1 blaCTX-M-182)、およびグループ 9 blaCTX-M-14 を持つプラスミドを含む 1 (9.1%) (表 3)。

宿主複製中のプラスミドの維持は、伝染性の重要な側面です。 我々は、以前に記載された PCR ベースの検出システムに従って、8 つのプラスミドにコードされた中毒システムの存在を調査しました 19。 6 つのプラスミド中毒システム タイプ (pemKI、ccdAB、vagCD、hok-sok、pndAC、および srnBC) が、75 の親分離株 (表 4) および対応するプラスミド受容株 (表 5) の間で同定できました。 親株で検出されたプラスミド付加系の組み合わせは、pemKI (n = 72)、srnBC (n = 68)、ccdAB (n = 68)、vagCD (n = 55)、pndAC (n = 48)、hok の 337 通りでした。 -sok (n = 26)。 relBE および parDE プラスミド中毒システムは、分析された親大腸菌株では検出されませんでした。 一方、プラスミド受容株では、pemKI (n = 47)、srnBC (n = 42)、ccdAB (n = 39)、vagCD (n = 21) からなる合計 176 のプラスミド中毒システムの組み合わせが同定されました。 、pndAC (n = 23)、および hok-sok (n = 4)。 繰り返しになりますが、どの株も relBE および parDE プラスミド中毒システムを持っていませんでした。

プラスミドレプリコンタイプの組み合わせと検出された依存症システムの平均数との間には直接的な相関関係があった(表3)。 中毒システムの平均数が最も高かったのは、4 種類のレプリコンを組み合わせたプラスミドで観察されました。 対照的に、依存症システムの平均数が最も低かったのは、単一の Inc レプリコン タイプを持つプラスミドと相関していました。 しかし、ドナー親株（表 4）またはレシピエント株（表 5）のいずれにおいても、プラスミド中毒システムの組み合わせの平均数と、CTX-M を含むβ-ラクタマーゼの種類との間に明確な相関関係は確認できませんでした。

細菌のバイオフィルムとプラスミドの間の相互作用に関する知識は、抗菌薬耐性プラスミドの伝達性を制御する治療法の開発に役立つ可能性があります。 したがって、マイクロタイタープレートアッセイでバイオフィルムを形成する能力について、12のドナー親株と対応するプラスミドレシピエントの能力を比較しました。 このサブセットを選択するための基準は、(1) B2 系統型に主に焦点を当てること、なぜならこれらは通常腸外細菌であるため、(2) ST131 国際高リスククローンに主に焦点を当てること、(3) ST131 を有する分離株の広がりである。 (4) 1 つから複数の CTX-M 型を持つ広範囲の分離株、および (5) すべての地理的研究施設を代表する必要がある [NRL (National Reference Laboratory)-4; TASH（ティクル・アンベッサ専門病院）—3; ARH (エイダー紹介病院) - 3; JUH (神馬大学病院)—1] (補足表 S1)。 ドナー親「P」株は 2 つだけが、強力なバイオフィルム形成型である P106、または中程度のバイオフィルム形成型である P107 として分類できました (図 3)。 残りのドナー親株は、試験した実験条件下でバイオフィルム形成能が弱いか（P2、P3、P22、P154、P163、P174、およびP184）、またはバイオフィルムを形成できなかった（P9、P74、およびP149）かのいずれかでした（図3）。 興味深いことに、P22、P154、およびP184プラスミドから伝達可能なプラスミドのみが、レシピエント「R」株（R22、R154、およびR184）に、ある程度のバイオフィルムを形成する能力を与えることができました（図3）。 これら 3 つの分離株で同定されたレプリコンの種類は、それぞれ F-FIB、F-FIA-FIB、および F-FIA-FIB でした (補足表 S1)。 したがって、我々は、P22、P154、および P184 由来 AMR プラスミドがプラスミドにコードされたバイオフィルム促進因子を捕捉した可能性がある 3 つのケースのみを特定できました。

エチオピアの患者から分離された病原性大腸菌株のバイオフィルム形成効率。 データは、各分離株について少なくとも 3 つの生物学的複製と 3 つの技術的複製から生成され、GraphPad-5.0 を使用してプロットされました。 組み込みの Tukey の多重比較検定を備えた一元配置 ANOVA を適用して、対照株大腸菌 J53 (黒いバー) と親株 (「P」、濃い灰色のバー) およびそれぞれのレシピエント株 (「R」、明るい灰色) の間の統計的有意性を計算しました。バー）。 P < 0.0001: ***P < 0.001: **P < 0.01: *P > 0.05: 有意ではない (ns)。

AMR プラスミドの保有は血清耐性の程度に影響を与えるため 16、我々はドナー親株の選択されたグループと対応するプラスミド受容株の正常ヒト血清に対する耐性を与える能力を比較しました。 上記で選択した分離株のうち 10 株も、この血清感受性研究で使用されました (補足表 S1)。 2つの親「P」分離株（P9およびP74）と4つのレシピエント「R」株（R2、R9、R74およびR106）は、ヒト血清への長期曝露に対して完全に感受性でした（図4）。 これは、対照株大腸菌J53の血清感受性表現型に匹敵した。 一方、8 つの親株 (P2、P3、P22、P106、P107、P154、P163、および P174) および 6 つのレシピエント株 (R3、R22、R107、R154、R163、および R174) は広範な血清耐性を示しました。 したがって、P3、P22、P107、P154、P163、および P174 株の血清耐性は、伝染性 AMR プラスミド保菌によって影響されます。 これらの6つの分離株で同定されたレプリコンタイプは、それぞれF-FIA-FIB-I1、F-FIA-FIB、F-FIA-FIB、F-FIA-FIB、WおよびF-FIA-FIBでした（補足表S1）。 対照的に、P2 および P106 株の血清耐性は伝染性ではなく、染色体にコードされた要素または非伝染性プラスミドにコードされた要素と関連している必要があります。

血清の存在下で増殖した病原性大腸菌株の生存効率。 10 の親臨床分離株 (濃い灰色のバー) とその対応するレシピエント株 (明るい灰色のバー) および対照株 J53 (黒色のバー) の、活性ヒト血清に 0 時間および 3 時間曝露した後の生存特性。 死滅に対する感受性は以下のように計算した：log kill = (最初に添加した細菌1ミリリットルあたりのlog10 CFU - 0時間) - (3時間後のインキュベーションで生き残った細菌1ミリリットルあたりのlog10 CFU)。 GraphPad-5.0 を使用して、すべての分離株の少なくとも 2 つの生物学的複製からのデータをプロットしました。 結果の平均値と標準誤差を示します。 内蔵の Tukey の多重比較検定を備えた一元配置 ANOVA を適用して、対応する親株とレシピエント株の間の統計的有意性を計算しました。 P < 0.0001: ***P < 0.001: **P < 0.01: *P > 0.05: 有意ではない (ns)。

この研究は、エチオピアのCTX-M産生MDR大腸菌臨床分離株におけるプラスミド伝播性、レプリコンの種類、および関連する中毒システムについて報告した最初の研究である（補足表S1）。 また、これは、CTX-M 産生大腸菌臨床分離株のクローン分布と関連して、これらのプラスミド レプリコン タイプを記載したエチオピアでの最初の研究でもあります。 このデータは、遺伝子の水平伝播がエチオピアにおけるCTX-Mをコードする遺伝子のクローン拡大と広範な分布の主な原因であるという長年の考えを裏付けるものである。 これらの発見は、プラスミドの伝達が、エチオピアの細菌集団間での非セファロスポリン系抗菌薬に対する耐性をコードする遺伝子の同時伝達の主要な要因であることを示しているため、憂慮すべきである。 その結果、介入がなければ、臨床、農業、地域社会の環境における細菌集団の間での多剤耐性の急速な広がりは衰えることなく続くだろう。 不安な慰めは、分離株が依然として非常に感受性が高かったメロペネムなどの最後の手段であるカルバペネム薬である。 MDRグラム陰性感染症の最終手段であるコリスチンに対する耐性の可能性については、研究時点ではエチオピアでの臨床使用が承認されていなかったため、試験されなかった。

検査された分離株の 75% には伝達可能なプラスミド上に CTX-M 遺伝子が含まれていましたが、残りの 25% の分離株はこれらの遺伝子を大腸菌レシピエントに伝達できませんでした。 さらに、代替のβ-ラクタマーゼ blaSHV も非伝播性でした。 これらの伝達不能な blaCTX-M および blaSHV 遺伝子は、宿主染色体に組み込まれるか、伝達不能なプラスミド上に存在する可能性があります。 これらの分離株は、MDR マーカー間の遺伝的異質性の増大とその伝播に関する新たな手がかりを提供する可能性があるため、さらなる遺伝的特徴付けを行う価値があります。 このタイプの新規発見の前例は、非常に広範な AMR および ST131 H30Rx20 の毒性サブクローンにおける blaCTX-M-15 の染色体位置です。 この起源は、プラスミドに位置する Tn3 様 ISEcp1-blaCTX-M-15-orf477 エレメントの動員によるもので、その後細菌ゲノムに組み込まれました。 ISEcp1 は、複数のソースからの AMR 遺伝子の効果的な捕捉、発現、動員に寄与する IS であり、一般に CTX-M コード遺伝子の領域の上流に位置します 21,22。 親株の 97.3% および対応するレシピエント株の 94.7% における ISEcp1 の我々の観察は、これらの以前の発見を裏付けるものです。

プラスミド配列データがなければ正確な遺伝子関連を直接決定することはできませんでしたが、59 (78.7%) の伝達可能な blaCTX-M 遺伝子が狭い宿主範囲の IncF プラスミド上に位置しているようでした。 これは、IncF プラスミドが blaCTX-M 遺伝子の主要なキャリアであることと一致します 23。 CTX-M をコードする IncF プラスミドは、さまざまな種類の大腸菌で検出されます 24 が、CTX-M-15 を産生する大腸菌 ST13123 の世界的な広がりと特に強い関連性があります。 IncF プラスミドは、ST131 クローン 25 の成功、および H30R1 や H30Rx を含む H30 などの ST131 亜系統の進化を選択する競合適応性の利点を生み出すさまざまな AMR 決定基および病原性関連因子に寄与します。 このプロファイルと一致するのは、国際的な高リスク大腸菌 ST131 系統を含む、さまざまな大腸菌配列タイプの系統に関連する分離株が保有する IncF プラスミドの観察です。 これは、エチオピアにおける CTX-M-15 コード遺伝子の広範な蔓延が、宿主細胞のクローン増殖と IncF プラスミドによる水平遺伝子導入の両方によって促進されていることを示しています。 我々はまた、主に共生大腸菌であると考えられている大腸菌系統群内の IncF プラスミドを同定し、以前の主張を裏付けました 27。

この研究で特定された IncF プラスミドは単一レプリコンまたは複数レプリコンのいずれかを持っていると考えられます。 異なる組み合わせは、レプリコンキメラを生成する異なるタイプ間の融合、または複数のプラスミドが同じ細胞内に同時に共存することを反映している可能性があります18、24、28、29。 この現象は、関連する疫学的プラスミド系統を確立および追跡するのに非常に役立ちます。 しかし、同じ不和合性グループ内に複数のレプリコンを持つプラスミドによってもたらされる適合性の利点は明らかではありません。なぜなら、不和合性現象によってもたらされる複製調整、制御、および不安定性の問題が確実に生じるからです。 これは、さまざまな不和合性グループからレプリコンを取り込むプラスミドとは対照的であり、これにより多様な宿主内での複製の機会が拡大されます。 したがって、全ゲノムまたはプラスミドの配列決定に焦点を当てた追跡調査では、IncF プラスミド レプリコンが別個の完全な遺伝実体を表すかどうか、または以前に報告されているように、レプリコン キメラを作成する異なるタイプ間の単なる融合であるかどうかを評価する必要があります 18。 レプリコンの機能を評価することも保証されています。

興味深いことに、この研究で分析された 8 つの依存症システム タイプから、3 つのタイプ I および 3 つのタイプ II 依存症システムを検出できました。 親のドナー分離株では、これは追加システムの 337 の組み合わせに相当します。 しかし、レシピエント接合接合体で検出された依存症システムの組み合わせはわずか 176 件でした。 他の人が示唆しているように、これらの発見の意味は、中毒システムが非接合プラスミドまたは染色体に位置している可能性があり、接合プラスミドに位置するものは伝達可能なblaCTX-M遺伝子に関連しているということです19、30、31。 さらに、レシピエント株で検出されたほぼすべての依存症システムは IncF プラスミド上に保持されており、以前の発見を裏付けています 32。 プラスミド中毒システムは、細菌集団におけるプラスミドの安定性と維持において重要な役割を果たしており 33、不利な環境条件下で細菌の適応性を高めることができます 34。 したがって、我々のデータは、IncF プラスミドがエチオピア分離株内での blaCTX-M 遺伝子の水平伝播時の維持と安定性のために複数の中毒システムを使用していることを示しています。

これに対する追加の重要な要素は、これらの blaCTX-M 保有プラスミドが、スルファメトキサゾール/トリメトプリム、シプロフロキサシン、アモキシシリンクラブラン酸、ゲンタマイシン、アミカシン、そしてセフォキシチン。 これは、blaCTX-M 遺伝子を含むプラスミドが病院、地域社会、農業環境に MDR を迅速に蔓延させる可能性を強調しています。 したがって、エチオピアにおける非ベータラクタム系抗生物質耐性の起源と進化をより深く理解することが必要です。

限られた医療環境で収集された大腸菌分離株における伝染性AMRプラスミドの同定と初期の特徴付けにもかかわらず、それらの間に存在する可能性のある遺伝的多様性に関する重要な知識がまだ不足していることは明らかです。 フォローアップ研究では、プラスミドの多様性の程度をより明確に定義するため、また、プラスミドのバックボーンとレプリコンのタイプを、獲得された複数の耐性遺伝子と中毒モジュールの組み合わせ、およびそれに関連する他の表現型形質と結び付ける重要な情報を提供するために、プラスミドのさらなる遺伝的特徴付けに焦点を当てるべきである。血清耐性やバイオフィルムを形成する能力などの病原性。 これを達成するには、S1 ヌクレアーゼを介したプラスミドの切断、その後のパルスフィールドゲル電気泳動とサザンブロッティング 35 を組み合わせた方法、さらには直接プラスミド配列決定と組み合わせた方法、さらには全ゲノム配列決定を組み合わせた方法が必要となります。 この研究でのほとんどの伝達性プラスミドが他の研究で広範な遺伝的多様性を示した IncF ファミリーに基づいていたことを考慮すると 36,37,38,39 、これは我々の分離株コレクションに含まれるプラスミドにも当てはまるのではないかと推測されます。 さらに、我々の PBRT アッセイによると、かなりの割合の伝染性プラスミドが型別のないレプリコンを持っていました。 したがって、この分離株群に対してより洞察力のある遺伝的手法を適用することは、エチオピアのさまざまな大腸菌集団の間での AMR の蔓延に関する新たな手がかりも提供するでしょう。

IncF プラスミドとは別に、我々は、IncI1-Iγ または IncY レプリコンを持つ伝染性の狭い宿主範囲のプラスミドを保有する分離株にも興味を持っていました。 配列に基づく方法では確認されていないが、我々の研究で同定されたIncI1-IγおよびIncYプラスミドは、多くの場合、blaCTX-M-15遺伝子と関連していることが判明した。 興味深いことに、これらのレプリコンを持つプラスミドは、食用に生産された動物から単離された細菌から検出されており、さまざまな AMR 遺伝子と関連しています 40、41、42、43。 この先例に基づくと、本明細書で同定されたIncI1-IγおよびIncYプラスミドは動物起源である可能性があり、それがエチオピアにおけるヒトへの感染源となる可能性がある。 このことは、より広範な地域社会や農業源からの分離菌を含むように拡張されたエチオピアの細菌コレクションを用いた今後の研究で確認されるだろう。 私たちの研究で検出された他のレプリコンは IncL/M だけでした。 これは、IncL/M プラスミドと blaCTX-M-3 および blaOXA-48 の伝播との関連によって証明されるように、多様な細菌種間でのより大きな伝播を可能にする広範な宿主範囲のレプリコンです 44,45。

さまざまな大腸菌の病型は、感染したヒトと動物の宿主内および宿主間での侵入、定着、生存、および伝播をサポートするさまざまな病原性関連因子を持っています。 私たちの分離株の病型に関する最終的な結論には、以前の研究で定義されている顕著な毒性遺伝子の存在を特定するための配列分析が依然として必要です46、47、48。 病原性関連因子がプラスミドなどの可動性遺伝要素内にコード化され得ることは十分に確立されている49。 このことは、親分離株のサブセットとその対応するプラスミド受容株の正常ヒト血清中での生存性を明らかにしたこの研究にも反映されており、これはCTX-Mをコードする耐性プラスミド上に担持される特定の遺伝子に起因するものである。 データは限られているが、エチオピアで採取された多くの大腸菌分離株からのAMRプラスミドが、環境生存と宿主の病原性に重要なライフスタイルの選択に影響を与える可能性のある他の特性もコードしている可能性が高いという事実を示唆している。

また、blaCTX-M-14、blaCTX-M-15、および blaCTX-M-27 遺伝子を含むほとんどの分離株が B2、D、および F 系統群に分布していることにも注目しました。 世界規模の集団調査では ExPEC 細菌が B2 および D 系統群に含まれることが日常的に関連付けられているため、これらは腸管外病原性大腸菌 (ExPEC) 分離株である可能性があります 50。 ExPEC 細菌が世界的な主要な臨床問題であることを考えると、これは深刻な懸念です 51。 したがって、エチオピアでは ExPEC の有病率が高いと推測されますが、これはより広範な大腸菌コレクションで検証する必要があります。 これは、エチオピアで進行中の One Health 研究所ベースの AMR 監視イニシアチブを通じて、多様かつ拡大する大腸菌分離株コレクションにアクセスできるため、達成可能です。 プラスミドにコードされたAMR遺伝子と共局在する毒性関連因子の同定は、急性の健康リスクを引き起こす新規および再出現の細菌性病原体の進化に大きな影響を与えるだろう。

ExPEC 株である可能性が低い系統分類グループ A、B1、および C に関連する分離株にも関心が寄せられています。 むしろ、それらは腸の非病原性共生分離株または腸の病原性分離株（InPEC）のいずれかでなければなりません。 いずれにせよ、それらは便以外のサンプル、主に尿から分離されており、腸管外感染との関連が示唆されており、消化管からの転座が必要となる可能性がある。 InPEC は腸管外感染をほとんど引き起こさないため 52、他の系統群 A、B1、および C に属する残りの腸管外分離株は共生大腸菌に由来すると考えられます。 この考えには確認が必要ですが、特に免疫不全患者で胃腸関門が突破され、細菌数が特に高い場合には、共生大腸菌株が腸外感染に関与する可能性があることがわかっていることから前例が得られています53。

私たちの研究には一定の限界があります。 どの blaCTX-M 遺伝子が同定されたプラスミド レプリコン タイプと遺伝的に関連しているかは直接決定されませんでした。 blaCTX-M遺伝子を移入しなかった分離株の遺伝的特徴付けも行われなかった。 さらに、プラスミド配列データがなければ、信頼できる遺伝的関連性を直接推測することはできません。 さらに、大腸菌分離株における伝播性 AMR プラスミドの私たちの同定と初期の特徴付けは、限られた医療現場から収集されたものであり、全国的な代表性を持っていません。 したがって、より広い地域社会や農業源からの分離株を含むように拡大されたコレクションに関する今後の研究において、結果を確認する必要がある。 将来の研究では、プラスミド移入の有効性とプラスミドの遺伝的特徴との関係が精査されることになる。この情報は、疫学者やエチオピアの監視だけでなく、世界の科学コミュニティにとっても、感染拡大の成功とその成功を関連付ける上で重要となるからである。プラスミドの種類と移動性を備えた抗生物質耐性遺伝子の伝播。

結論として、エチオピアでは CTX-M および他の AMR 遺伝子の動員に関与している可能性のある IncF 様プラスミドの普及率が高いことを報告します。 これらのプラスミドは、主に国際的に成功した ST131 系統から同定されており、効果的な遺伝子捕捉のための ISEcp1 エレメントと、娘細胞におけるプラスミド維持を選択するための複数の中毒システムを備えています。 このデータは、以前に報告されたエチオピアにおける blaCTX-M-15 の広範な蔓延の根本的な分子的根拠を示しています 11。 エチオピアの腸外大腸菌集団間での AMR 遺伝子の拡散における伝達性プラスミドの役割に関する知識は重要なステップです。 それは国の感染予防および制御システムの強化に役立つだけでなく、そのようなプラスミドを保有する細菌を標的として、その後の細菌集団内での AMR の獲得および伝播を制限する治療戦略を開発する可能性も開きます 54,55。 全体として、データは、エチオピアの 4 つの施設から分離された CTX-M ESBL 産生大腸菌の間で高い AMR プラスミド保菌率を示しています。 その結果、プラスミド伝播の可能性が非常に高く、多様なファミリーの AMR 遺伝子がさらに急速に拡散する可能性も高くなります。

分離株は、進行中の国家AMR監視イニシアチブの一環として2018年に地理的に異なる4つの施設から収集された後、バイオバンクから回収された。 このイニシアチブは、保健省の監督下で EPHI によって 2017 年に開始され、世界保健機関のグローバル AMR および使用監視 (GLASS) イニシアティブの後援の下で運営されています (https://www.who.int/initiatives/glass) ）。 患者の包含基準と除外基準を含む詳細なサンプル収集手順は他の場所で報告されており 11,56、オハイオ州立大学 Global One Health イニシアチブによって確立された臨床微生物学的サンプリングの標準慣行に厳密に準拠しています 57。 バイオバンク内のすべては臨床分離株であり、一般集団やその他の疫学シナリオからの分離株ではありません。

我々の最近の研究では、204 個の ESBL 産生大腸菌臨床分離株について、初期の表現型の特徴付け、株のスクリーニング、系統分類、β-ラクタマーゼ遺伝子の検出、抗生物質感受性検査が報告されました11。 現在の調査では、元のセットの尿 (n = 84)、膿 (n = 10)、血液 (n = 6) から得られた 100 個の CTX-M 産生分離株を検討しました。 最初の研究で同定されたすべての CTX-Ms をコードする遺伝子型がこのサブコレクション内に含まれていたため、100 個の分離株に焦点を当てるだけで十分でした。 しかし、尿からの分離株が過剰に存在することは、これらの菌株のほとんどが泌尿生殖器への浸潤に関連する病原性因子が豊富であることを示唆しています。 さらに、収集時の抗菌薬への曝露に関するデータはありません。 分離株が得られた特定の患者が抗菌療法を受けており、特定の抗菌薬耐性遺伝子が過剰発現する傾向にある可能性が考えられるため、これは関連性がある可能性があります。

この研究は、EPHI 科学倫理審査委員会 (EPHI-IRB-054–2017) およびアディスアベバ大学自然計算科学部施設審査委員会 (CNS-IRB/039/2019) によって承認されました。 この研究に含まれるすべての細菌分離株はバイオバンクから調達されたため、この研究には患者、人的資料、または個人データの識別子は直接関与していません。

プラスミドは、結合または化学的形質転換法のいずれかによって導入されました。 結合は、大腸菌 J53 AziR をレシピエント株として使用する接合アッセイによって実行されました 58。 トランス接合体は、アジ化ナトリウム (150 μg/mL) およびセフォタキシム (2 μg/mL) を含むルリア ベルターニ寒天 (LA) プレート上で選択されました。 このため、すべてのドナー株のアジ化ナトリウムに対する感受性を事前にテストし、大腸菌 J53 AziR のセフォタキシムに対する感受性を事前にテストする必要がありました。 プラスミドが非接合性である場合、レシピエント株大腸菌HB101 (Promega、スウェーデン)を使用して化学的形質転換を実施した。 GeneJET プラスミド ミニプレップ キット (Thermo Fisher Scientific Inc.) を使用してプラスミドを精製し、42 °C での熱ショックを使用して化学的にコンピテントなレシピエント株に形質転換しました。 形質転換体は、セフォタキシム (2 μg/mL) を補充した LA プレート上で選択されました。

分離株は、前述のように確立された PCR と配列決定法の組み合わせを使用して、ESBL をコードする遺伝子 blaTEM、blaSHV、blaCTX-M および blaOXA の存在について分析されました 59。 精製された PCR 産物は、Eurofins genomics (Ebersberg、ドイツ) のサービスを使用して配列決定されました。 β-ラクタマーゼ遺伝子タイプは、BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) を使用して GenBank の配列とアラインメントすることによって同定されました。 blaCTX-M の転移を確認し、関連する他の耐性表現型の転移を検出するために、転移可能な親分離株およびそれに対応する AMR プラスミドのレシピエントに対する 10 種類の抗生物質について抗生物質感受性試験を実施しました。 アッセイでは、CLSI の推奨に従って、ミュラー・ヒントン寒天プレート上でディスク拡散法を使用しました。 抗生物質を含むディスクのパネル (Oxoid LTD、英国ハンプシャー州ベイジングストーク) とその略称は、アモキシシリン-クラブラン酸 (AMC-20/10 μg)、セフォキシチン (FOX-30 μg)、セフォタキシム (CTX-30 μg) でした。 、セフタジジム（CAZ-30μg）、セフェピム（CEF-30μg）、ゲンタマイシン（GEN-10μg）、アミカシン（AMK-30μg）、シプロフロキサシン（CIP-5μg）、メロペネム（MEM-10μg）およびスルファメトキサゾール/トリメトプリム（SXT-23.75/1.25μg）。 感受性は、CLSI 文書 M100-S30 (CLSI、2020) に従って解釈されました。 ESBL 陰性大腸菌 ATCC 25,922 および ESBL 陽性肺炎桿菌亜種 25,922 肺炎ATCC 700,603 (米国ミネソタ州セントクラウドのMicrobiologics Inc.)を参照株として使用した。

5 つの多重反応セットアップと 3 つの単一反応セットアップで 18 のプライマーペアを含む PBRT プロトコール 60 を使用して、AMR プラスミド レプリコン タイプ FIA、FIB、FIC、HI1、HI2、I1-Ig、L/M、N、P、W、T を特定しました。 、A/C、K、B/O、X、Y、F、FIIA。

前述の PCR プライマーペアと増幅条件を使用して、75 人の親ドナーとそのそれぞれのレシピエント株について 8 つの中毒システムが決定されました 19。 これらには、3 つのタイプ I 依存症システム [Hok-Sok (hok-sok) (宿主殺害)、PndA-PndC (pndAC) (核酸分解の促進)、および SrnB-SrnC (srnBC) (安定した RNA 陰性) の検出が含まれます。 )] および 5 つの II 型中毒システム [PemK-PemI (pemKI) (プラスミド緊急維持)、CcdA-CcdB (ccdAB) (細胞分裂と共役)、RelB-RelE (relBE) (緩和制御の安定した RNA 合成)、ParD- ParE (parDE) (DNA 複製)、および VagC-VagD (vagCD) (毒性関連タンパク質)]。

挿入配列 ISEcp1 の検出は、以前に記載されているように、ISEcp1 プライマーと CTX-M リバースコンセンサスプライマー (MA1 リバース) の組み合わせを使用する PCR によって決定されました 61。 増幅産物は、blaCTX-M 遺伝子の上流に位置する ISEcp1 エレメントを示します。 PCR産物を精製し、配列決定によって確認した。

12 の親分離株についてバイオフィルムの形成が測定されました。 選択された分離株とそれらの検出された遺伝子型および表現型は補足表 S1 にリストされています。 すべての親分離株は、既知の腸外病原性大腸菌 (系統群 B2 および D) に属していました。 分離株 149 を除くすべては、国際的な高リスククローン ST131 です。 すべてが少なくとも 1 つの CTX-M タイプを生成し、分離株 74 を除くすべてが複数の IncF プラスミド レプリコン タイプの検出を示しました。 親分離株とその対応するレシピエントのバイオフィルム形成能力の測定には、以前に記載されたプロトコールに若干の変更を加えて使用しました62。 簡単に説明すると、両グループの細菌を、炭素源としてグリセロールを使用し、それぞれの抗生物質を含む M63 最少培地で、通気を行いながら 37 °C で一晩増殖させました。 ドナー親株にはセフォタキシム (2 μg/ml) を使用し、レシピエントには 2 μg/ml セフォタキシムと 100 μg/ml アジ化ナトリウムを使用しました。 大腸菌J53 AziR株を対照として使用し、100μg/mlのアジ化ナトリウムを含むM63培地で増殖させた。 一晩の細菌培養物から、3μlのアリコートを、滅菌96ウェル丸底μlディッシュのウェル内の147μlの新鮮なM63培地と混合し、37℃で一晩インキュベートした。 発達したバイオフィルムを熱固定し、0.1% w/v クリスタル バイオレット溶液で染色しました。 染色されたバイオマスを、33% (v/v) 氷酢酸中での可溶化によって回収した。 次いで、可溶化バイオフィルムの程度を５６０ｎｍの吸光度で分光学的に記録し、浮遊増殖による正規化により計算したバイオフィルム形成効率を波長６００ｎｍでの光学密度として記録した。 特異的バイオフィルム形成 (SBF) は、式 SBF = (AB-CW)/G を使用して決定されました。ここで、AB は染色細胞の OD560、CW は M63 培地のみで培養した対照ウェルの OD560、G は細菌の OD600 です。増殖は G = OD600 (24 時間) - OD600 (0 時間) から計算されます。 菌株は、弱いバイオフィルム形成力（SBF ≤ 0.5）、中程度のバイオフィルム形成力（SBF = 0.5 ～ 1.0）、および強いバイオフィルム形成力（SBF ≥ 1.0）に分類されました。 ロジスティック上の理由から、データの品質を確保するために、少なくとも 3 つの生物学的反復と 3 つの技術的反復を可能にするために、サンプル サイズは 12 に制限されました。 さらに、選択プロセスにより、親分離株が異なる系統学的背景を表すことが保証されました。

血清感受性は、以前に記載されたプロトコールを使用して、10 個の親分離株およびそれらの対応するトランス接合体について測定されました 49。 簡単に説明すると、菌株を LB ブロス中で 37 \(^\circ\)C で通気しながら一晩増殖させました。 一晩培養したもの 5 μl を 495 μl の新鮮な LB ブロスに継代培養し、37 \(^\circ\)C で 2 時間静的に増殖させました。 7600gで3分間遠心分離した後、ペレットを500μlのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。 洗浄した細菌からの 20 μl を 96 ウェル平底マイクロタイター ディッシュ内で 180 μl の正常ヒト血清と混合し、37 °C で 3 時間静的にインキュベートしました。 0 時間および 3 時間の時点で、20 μl をウェルから取り出し、適切な段階希釈後、親株の場合は 2 μg/ml セフォタキシム、トランス株の場合は 2 μg/ml セフォタキシムおよび 100 μg/ml アジ化ナトリウムを含む LB プレートに播種しました。結合体、および大腸菌 J53 AziR コントロールには 100 μg/ml アジ化ナトリウム。 プレートを 37 °C で一晩インキュベートした後、細菌のコロニー形成単位 (CFU) の数を測定しました。 活性血清に対する感受性は次のように計算されました: 以前の報告に従って、log kill = (最初に添加した細菌の log10 CFU/μl - 0 時間) - (3 時間後のインキュベーションで生き残った細菌の log10 CFU/μl)。 すべての実験は二重に実施されました。 10 個の分離株の選択プロセスにより、親分離株が異なる系統学的背景を表すことが確認されました。 すべてのアッセイにおいて、レシピエント J53 株のみを対照として使用しました。

データは Excel スプレッドシート (Microsoft Office) を使用して作成され、SPSS バージョン 20.0 にインポートされました。 さまざまな変数の頻度が計算されました。 クロス集計とグラフを使用して、データ間のさまざまな関係を示しました。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

抗菌耐性

アフリカ検査医学協会

抗菌薬感受性試験

β-ラクタマーゼをコードする遺伝子

基本的なローカル位置合わせツール

コロニー形成ユニット

臨床検査標準機関

セフォタキシム治療中、ミュンヘンで初めて分離

エチオピア国家認定局

拡張スペクトルβ-ラクタマーゼ

遺伝子の水平伝達

治験審査委員会

識別

非互換性

挿入シーケンス

国際標準化機構

ラウリア・ファーミング寒天培地

ラウリア・ベルターニ

多座位配列タイピング

オキサシリナーゼ

特異的なバイオフィルム形成

スルフヒドリル変数にちなんで命名されたβ-ラクタマーゼ酵素

認定に向けた段階的な検査室の品質向上プロセス

シーケンスタイプ

ギリシャの患者テモニエラにちなんで命名されたβ-ラクタマーゼ酵素

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著者らは、国家AMRサーベイランスプログラムの一環として、検体収集に参加した人々、ならびに分離菌の初期同定と特性評価に尽力したEPHI臨床細菌学および真菌学の国立参考検査室スタッフに感謝の意を表したい。 著者らはまた、細菌株 E coli J53 AziR を提供してくださった Stephan Göttig (ヨハン ヴォルフガング ゲーテ大学病院) に感謝します。

ウメオ大学が提供するオープンアクセス資金。 この研究の側面は、一部はウメオ大学医学財団、一部はスウェーデン研究評議会医学と健康（助成金番号 2014–06652 および 2018–02676）の支援を受けました。

国立臨床細菌学および真菌学参照研究所、エチオピア公衆衛生研究所、アディスアベバ、エチオピア

アベベ・アセファの作り方

アディスアベバ大学、自然計算科学学部、微生物・細胞・分子生物学科、アディスアベバ、エチオピア

アベベ・アセファ - ネグリ (公式ビデオ)

ウメオ大学、分子生物学部、ウメオ、スウェーデン

アベベ・アセファ・ネグリ、ダルメンダー・K・ガロット、ジョティ・M・グルン、マシュー・S・フランシス

ウメオ微生物研究センター、ウメオ大学、ウメオ、スウェーデン

ダルメンダー K. ガロット、ジョティ M. グルン、マシュー S. フランシス

オハイオ州立大学の Global One Health Initiative、東アフリカ地域事務所、アディスアベバ、エチオピア

エヤス・ティガブ・セヨウム

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AAN は研究を設計し、実験を実施し、最初の原稿草稿を書きました。 HM は研究を計画し、監督を行いました。 DKG が事前に形成したバイオフィルムの実験、データ分析、図の作成。 JMG は監修、データ分析、図の作成を行いました。 ETS は表現型実験を実施し、技術的な洞察を提供しました。 MSFは研究を企画し、監督を行い、資金を獲得し、原稿を改訂した。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

マシュー・S・フランシスへの通信。

著者らは、潜在的な利益相反とみなされる可能性のある商業的または金銭的関係が存在しない状態で研究が実施されたことを宣言します。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

ネグリ、AA、マモ、H.、ガーロット、DK 他。 エチオピアの腸外大腸菌臨床分離株のうち、blaCTX-M 遺伝子を保有するプラスミドの特性評価。 Sci Rep 13、8595 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35402-2

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受信日: 2022 年 7 月 7 日

受理日: 2023 年 5 月 16 日

公開日: 2023 年 5 月 26 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35402-2

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